来源：本站 作者：admin 时间：2019/1/8

【前言】

流式细胞仪最初的研究就是集中于测量发育异常的细胞遗传物质的数量变化，至今这项技术仍是植物生物学中评估基因组的大小和倍性水平参考方法。植物DNA水平的鉴定对植物种质资源、物种进化、物种分类、生态学研究、倍体育种等方面具有重要意义。

【方法原理】

      细胞核在提取液中机械地从约1cm² (或20mg) 组织中提取出来，过滤后，细胞核被包含PI或者DAPI（SysmexPartec）的染色液染色，随后在流式细胞仪上检测。流式细胞仪需配置一个或者多个绿色（PI）、蓝色（PI）和紫外（DAPI）激发光源。

图1 植物倍性分析样本准备步骤

【核悬液】

过滤阶段可移去组织碎片，然而一些碎片并不能被完全去掉，比如叶绿体、线粒体、可溶性的分类混合物、DNA酶和RNA酶等，这些都会影响分析的质量。加入抗氧化剂（亚硫酸盐、巯基乙醇）、单宁（PVP）、叶绿体裂解液（Triton）、RNA溶解液（RNA酶，冰浴）等可以降低这些物质对结果的干扰。

【参照物】

通常情况下，要选择与待测样本基因组大小相近的物种作为参照物。这个参照物需要和样本一起制备，以降低操作中引入偏差。已知内部参照物的DNA的重量（pg）或者碱基对（bp），通过参照物和样本的峰值准确计算待测样本。两个的换算公式为：

DNA 含量(bp) = 0.978 x 10⁹x DNA 含量 (pg)

【流式分析】

      为了清除未过滤掉的细胞碎片，流式细胞术通过SSC vs FL散点图设门。

图2 番茄样本的倍性分析。

A图显示SSCvsFL6(PI发射)，命名为“Nuclei”的门应用与B图中，B柱形图显示“Nuclei”门内FL6峰值。

【核内复制评估】

图2中使用的番茄样本显示出核内复制与DNA复制的相关性，如有丝分裂，但是没有区分核和细胞自身。核内复制的峰是叠加在经典的细胞周期峰上的：

2C→4C→8C→16C。还可以同时查看所以核分布信息，同时一些巧合也会产生假的峰‘2C + 4C’。

图3  番茄样本中的核复制以及峰值结果统计

【基因组检测】

      使用流式细胞仪对DNA准确地定量分析需要非碱基特异性的、DNA嵌合型染料。主要的嵌合型染料为PI和EB。

图4 使用已知DNA含量的大蒜作为参照物分析狗尾草的DNA含量

注：PK1 和PK2 分别为作为参照物大蒜的2C和4C的峰值，PK3 为狗尾草的峰值，从而计算出狗尾草DNA含量 = 123.97/49.50 = 2.50。2C 值计算为2.50 x 34.80 = 87.15 pg。

【AT/CG比例】

这个原理是基于DNA嵌合染料的使用相对于基数重复的荧光色素。例如，5 x AT Hoechst 33342和3 x GC 光神霉素的AT/GC比例的计算方法：

R_IP=待测物荧光强度/参照物荧光强度  PI检测

R_HO=待测物荧光强度/参照物荧光强度 Hoechst 33342检测

R_CA=待测物荧光强度/参照物荧光强度 Chromomycin A3检测

待测物AT % = 参照物AT% AT (R_HO/R_IP)^1/5和/或 待测物GC% = 参照物GC% (R_CA/R_IP)^1/3

最终得出的：待测物AT % +待测物GC %=100 %

【孤雌生殖和异倍体】

      孤雌生殖是一种不经过受精但产生种子生殖方式。其繁殖后代与母体是相同的。流式图中的峰是由于种子的胚胎和胚乳细胞由无特定的孤雌生殖以及孤雌生殖的方式产生。（图5）

图5 使用流式细胞仪在柱形图荧光通道里对繁殖方式的研究

      对于异倍体，峰的位置会被以下出现的情况影响：油菜籽(Brassica napus)的染色体包含n = 16和n = 19的染色体，因此会产生双峰。

【细胞周期】

在生理条件下，细胞自然呈现不同阶段的细胞周期的DNA图谱。

【试剂选择】

对于植物核含量的检测，主要的试剂为DAPI和PI，根据实验需求和仪器配置，可以对染料进行选择。具体区别罗列如下：

	DAPI	PI
激光光源	365nm	488nm或532nm
染色原理	只染色DNA	同时染色DNA和RNA
荧光强度	强	弱
荧光分辨率	高，CV<1%	低，CV>3%
激光光斑	大，对光斑定位依赖小	小，对光斑定位依赖大
染料毒性	强	低
染料粘附性	小	大
染色时间	短，<2min	长，>30min
结果稳定性	次生代谢对结果影响小	次生代谢对结果影响大
应用	倍性分析，细胞周期	倍性分析，基因组大小分析，细胞周期

常用试剂型号

货号	英文名称	中文名称	测试数
05-5001	CyStain® UV Ploidy	UV倍性分析试剂盒	250 tests
05-5002	CyStain® UV Precise P	UV精确P倍性分析试剂盒	250 tests
05-5002-a	CyStain® UV Precise P "automate"	UV精确P倍性分析试剂盒—自动	2 x 1000 ml
05-5003	CyStain® UV Precise T	UV精确T倍性分析试剂盒	250 tests
05-5003-a	CyStain® UV Precise T "automate"	UV精确T倍性分析试剂盒—自动	2 x 1000 ml
05-5004	CyStain® DNA 1 step	DNA一步法	250 tests
05-5005	CyStain® DNA 2 step	DNA二步法	250 tests
05-5022	CyStain® PI Absolute P	PI精确P倍性分析试剂盒	250 tests
05-5022-S	CyStain® PI Absolute P	PI精确P倍性分析试剂盒(小)	50 tests
05-5023	CyStain® PI Absolute T	PI精确T倍性分析试剂盒	250 tests